龚廷锋¹ , 文国松¹ , 赵明富²

1 云南农业大学中药材研究所, 昆明, 650201; 2 云南农业大学植物保护学院, 昆明, 650201
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2019 年, 第 17 卷, 第 16 篇   
收稿日期: 2019年01月04日    接受日期: 2019年02月13日    发表日期: 2020年02月12日

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为了探究铁皮石斛阿拉伯吡喃糖变位酶(UAM)基因的功能，本研究采用 RT-PCR 技术从铁皮石斛叶片中克隆出阿拉伯吡喃糖变位酶基因，获得 1 104 bp 的 ORF 序列并命名为 DoUAM，编码 367 个氨基酸，分子量大小为 41.433 kD。生物信息学预测表明：DoUAM 蛋白与模式植物拟南芥(AtRGP1 和 AtRGP2)和水稻 (OsUAM1) 的同源序列高度保守。Motif 预测表明 DoUAM 含有 DXD-Motif、KKXX-Like 基序和一个RGP 基序，三个糖基转移酶基序。系统发育分析结果显示，DoUAM 与 PeUAM1 亲缘关系最近，并将其归类到具有自我糖基化功能的 Class玉RGPs 亚族中。蛋白三维结构预测显示，DoUAM 蛋白的 Ile27, Gly51,Asp88, Asp108, Ile239 等残基可能与底物 UDP-Sugars 的糖基相互作用，Asp108、Asp109 和 Asp110 残基可能为二价金属离子的结合位点，以提高酶的活性。通过 DNA 同源重组技术(Clone express域, Vazyme)将其连接到 pBI121s 载体上，成功构建植物表达载体 pBI121s-DoUAM。利用农杆菌介导的浸花法转化到拟南芥(Col-0)中，经筛选获得 6 株具有卡那霉素(kan)抗性的 T2 代阳性转基因拟南芥植株，对 6 株再生植株进行PCR 检测表明，目的基因已经成功整合到拟南芥基因组中。表型观察发现 T2 代转 DoUAM 基因拟南芥植株生长较对照组(WT)缓慢，尤其是根生长缓慢，叶片瘦小，分析表明 DoUAM 可能与植物的发育有关。对转基因拟南芥植株的总多糖含量进行检测发现，转 DoUAM 植株多糖含量明显高于对照组(WT)，进一步分析表明铁皮石斛 DoUAM 基因与植物细胞多糖的合成有关。本研究结果为深入研究 DoUAM 基因在铁皮石斛发育过程以及多糖合成过程中可能发挥的功能和作用机制提供了帮助。

铁皮石斛；DoUAM；基因克隆；拟南芥